Come le componenti chiave della rete alimentare Antartica rispondono ai cambiamenti globali: un approccio “omico”

I sistemi marini sono minacciati dai cambiamenti climatici, che potrebbero in particolare avere effetti drammatici sulla biologia delle regioni polari a causa del ritiro dei ghiacci. I prossimi 30 anni vedranno probabilmente un drastico declino delle aree marine Antartiche ed Artiche coperte dai ghiacci, con estati polari prive di banchisa. I cambiamenti previsiti nelle catene alimentari sono per lo più valutati con modelli concettuali e quantitativi, che indicano marcati incrementi nella produzione primaria con il conseguente sviluppo di masse di fito- e zooplankton ed un aumentato flusso verso il benthos. Questi modelli collegano direttamente gli effetti di alterazioni temporali nelle fioriture di fitoplankton, l’abbondanza dello zooplankton e la salute delle popolazioni di pesce. Tuttavia, trascurano i cambiamenti nel microzooplankton, nonostante sia una fonte di cibo essenziale per le larve di pesce e quindi cruciale per lo sviluppo delle popolazioni adulte. Inoltre, la disponibilità di cibo è un fattore chiave in tutti i maggiori processi bentonici nei sistemi costieri Antartici. Le comunità zoobentoniche sono spesso composte da specie simpatriche con regimi di alimentazione molto diversi, per sfruttare al meglio la disponibilità di cibo nella colonna d’acqua. Infine, dato che molti invertebrati polari hanno tassi metabolici ridotti e vita lunga, i cambiamenti del loro habitat potrebbero avere effetti rapidi e misurabili su di essi.

Questo progetto punta ad investigare gli attuali effetti del riscaldamento globale sulle componenti chiave della catena trofica Antartica. Ci si propone di raggiungere questo obiettivo tramite analisi di sequenziamento massivo. L’assemblaggio de novo e l’annotazione dei trascrittomi previsti dal progetto intende fornire una piattaforma per ricerche avanzate, assieme agli studi di espressione genica da popolazioni naturali e sperimentalmente sottoposte a stress termico. L’obiettivo principale del progetto è quello di fornire informazioni di natura genetica e molecolare riguardo a firme molecolari di sofferenza nei confronti del progressivo innalzamento delle temperature a cui alcune regioni Antartiche sono state sottoposte negli ultimi 50 anni, analizzando un modello formato da micro-eucarioti, invertebrati e pesci prelevati in prossimità della base antartica Mario Zucchelli. Tali segni di stress termico, rilevati a livello trascrittomico, potrebbero indicare una plasticità fenotipica a livello molecolare e fisiologico messa in atto per fronteggiare questo aumento di temperatura.

La realizzazione di uno degli obiettivi del progetto si sarebbe basata sulla possibilità di comparare i profili trascrizionali ottenuti da organismi conspecifici/congenerici dalla Baia di Terra Nova (un sito non ancora impattato seriamente dal riscaldamento) e dagli stessi organismi sottoposti sperimentalmente a stress termico. Complessivamente, le attività previste dal progetto puntavano a costruire un atlante genico basato sulle attività fisiologiche nelle specie di interesse, in grado di investigare in un futuro prossimo se componenti chiave della catena alimentare Antartica stiano già soffrendo lo stress termico nella Penisola Antartica e quali siano i meccanismi molecolari utilizzati da queste specie per fronteggiare il problema.

L’attività in campo prevedeva campionamenti di protozoi, pesci nototenioidei, molluschi bivalvi e crostacei, in parte per sacrificio e trattamento sperimentale, ed in parte per sacrificio e prelevamento di tessuti per successivi sequenziamenti. Le principali specie scelte per facilità di reperimento sono state Trematomus bernacchii per quanto riguarda i pesci nototenioidei, Adamussium colbecki per quanto riguarda i molluschi bivalvi. Sebbene la specie scelta come rappresentante dei crostacei fosse l’Isopode Glyptonotus antarcticus, perché segnalato come abbondante in letteratura, la sua irreperibilità nei pressi della base Mario Zucchelli ha consigliato di ripiegare sul più comune Pseudorchomene plebs. Sono inoltre stati prelevati alcuni esemplari dei pesci Trematomus newnesi, Trematomus hansoni e Chionodraco hamatus e del crostaceo Eusirus giganteus.

Tutti i campioni sopracitati sono stati prelevati nel corso della XXXIII spedizione.

La XXXIV spedizione ha permesso di consolidare i dati raccolti nella spedizione dell’anno precedente, consentendo il campionamento di organismi unicellulari che non era stato possibile ottenere in precedenza a causa dell’inaccessibilità del sedimento prospiciente alla riva. Sono inoltre stati raccolti ulteriori campioni di pesci ed invertebrati Antartici per arricchire la collezione di organismi per i quali verrà descritto un trascrittoma di riferimento, e per fornire ulteriori repliche biologiche per conferma sperimentale dei trend di espressione tramite RT-PCR.

In seguito al trasporto in Italia, i campioni derivanti dai trattamenti sperimentali sono stati sottoposti ad estrazione di RNA, la cui qualità è stata immediatamente valutata al fine di determinare la possibilità di costruire librerie di sequenziamento RNA-seq. Laddove ciò sia stato possibile, si è dunque proceduto al sequenziamento Illumina paired-end, nel caso in cui fosse necessario procedere all’assemblaggio de novo del trascrittoma, oppure 3’-tag, nel caso in cui fosse già a disposizione un genoma o un trascrittoma di riferimento.

I trascrittomi assemblati de novo sono stati annotati funzionalmente ed utilizzato come riferimento per il mappaggio delle reads ottenute da sequenziamento, al fine di determinare i livelli di espressione, analogamente a quanto fatto per le risorge genomiche e trascrittomiche già disponibili.

Analisi statistiche bioinformatiche sono poi state condotte per identificare i geni differenzialmente espressi in risposta al trattamento nei diversi punti sperimentali, evidenziando alterazioni sia rispetto ai profili ottenuti da organismi campionati in ambiente esterno, sia rispetto a quelli di controlli appaiati mantenuti in vasche a temperatura controllata. Ciò ha permesso di valutare da un lato lo stress legato all’acclimatamento alle condizioni di controllo sperimentali, per il quale sono attualmente a disposizione scarse informazioni, e dall’altro di rilevare i processi biologici maggiormente impattati dall’aumento della temperatura in diversi tessuti. All’analisi di espressione genica differenziale sono stati appaiati test di arricchimento funzionale, per identificare i compartimenti cellulari, i processi biologici e le funzioni molecolari maggiormente associate ai geni differenzialmente espressi.

In parallelo alle analisi trascrittomiche, sono state condotte, laddove possibile, delle indagini istologiche sui campioni biologici raccolti, in modo da poter correlare l’eventuale presenza di significative alterazioni morfologico-funzionali al rilevamento a livello molecolare di alterazioni a carico di svariati processi biologici di rilievo.

Segue il dettaglio delle attività di ricerche condotte sulle diverse specie bersaglio del progetto.

Organismi unicellulari

Durante tutto il periodo di permanenza a MZS nella XXXIII spedizione, sono stati campionati ghiaccio profondo e acqua superficiale da 5 siti raggiunti in elicottero, quali Edomonson Point, Coulman Island, Cape Washington, Adelie Cove ed Inexpressible Island. Tale attività è stata resa possibile solo grazie all’efficienza della sala operativa ed al supporto delle guide nella trivellazione del pack. Purtroppo in questi siti non è stato però possibile effettuare campionamenti di sedimenti a causa dell’inaccessibilità delle aree prospicienti la costa, che dono dunque stati rimandati alla XXXIV spedizione.

Ghiaccio profondo e acqua superficiale sono stati raccolti anche nelle vicinanze della stazione MZS, in 4 differenti siti di Tethys Bay e da un sito di Road Bay, attraverso fori praticati nel pack mediante carotatore, grazie al supporto logistico. In due di questi quattro siti in Tethys Bay è stato possibile raccogliere anche sedimenti, grazie al lavoro svolto dai subacquei.

Tutti i campioni raccolti sono stati lasciati sedimentare alcuni giorni a +4°C ed è stata successivamente raccolta l’interfaccia sedimento/acqua per una preliminare osservazione microscopica che ha permesso di evidenziare la presenza di protozoi. Questi sottocampioni (10 ml ciascuno) sono stati posti in provette chiuse e conservati a +4°C per l’invio in Italia, presso l’unità dell’Università di Camerino.

Nel corso della XXXIV spedizione, come da PEA, sono stati effettuati due campionamenti nella spiaggia di Edmonson point per raccogliere campioni di microfauna nella zona tidale, che son stati selezionati e trattati in laboratorio e vengono spediti in Italia a + 4°C.

I campioni così ottenuti, unitamente ad altri campioni prelevati nell’ambito di precedenti progetti PNRA, hanno portato all’ottenimento di popolazioni stabili nei laboratori dell’università di Camerino sia per quanto riguarda Euplotes petzi che per quanto riguarda Euplotes euryhalinus. Entrambi gli organismi sono stati sottoposti ad un trattamento sperimentale con innalzamento della temperatura a 4°C e 12°C (rispetto alla temperatura di controllo, 0°C). In entrambi i casi i campioni prelevati hanno portato all’ottenimento di RNA di buona qualità in seguito ad estrazione, permettendo di preparare delle librerie paired-end per RNA-seq, che hanno consentito di ottenere degli assemblaggi de novo funzionalmente annotati di buona qualità.

Il trattamento ha prodotto effetti significativi in entrambe le specie, con alterazioni più rilevanti in risposta a tempi di esposizione più lunghi, pur mostrando una maggiore sofferenza in E. petzi. I dati indicano una significativa alterazione di numerosi processi biologici, inclusi quelli coinvolti in processi housekeeping di sintesi proteica e divisione cellulare, che sono attualmente in fase di analisi approfondita e saranno oggetto di prossima pubblicazione.

Il coinvolgimento di sistemi legati alla difesa da stress ossidativo in risposta all’innalzamento delle temperature erano già stati inizialmente teorizzati nelle prime fasi del progetto.

Adamussium colbecki

Nel corso della XXXIII spedizione, sono stati raccolti dai sommozzatori molti esemplari di Adamussium colbecki, dei quali sono stati sacrificati in seguito 5 esemplari di riferimento. Altri 40 esemplari sono stati acclimatati per un periodo variabile tra 4 e 6 giorni e divisi in maniera casuale nelle 2 vasche sperimentali, una a temperatura vicina a quella ambientale (controlli) e l’altra a temperatura aumentata di 1,5°C (sperimentali). L’esperimento è partito con il campionamento da ciascuna vasca a tempo 0 (5 esemplari) e a tempo 6 ore (5 esemplari). Sono stati effettuati 2 ulteriori campionamenti a 7 giorni (5 esemplari) e a 20 giorni (5 esemplari) dall’inizio del trattamento. Le temperature nelle vasche sono state monitorate con un data logger Tinytag Aquatic 2. Da ciascun esemplare sono stati prelevati branchie, epatopancreas e mantello, i quali sono stati immersi in RNAlater per 24 ore e successivamente stoccati a -20°C per l’invio in Italia. Sono stati anche fissati per l’analisi istologica i seguenti tessuti: emolinfa, branchie, ghiandola digestiva, gonade e mantello, conservati a +4°C per l’invio in Italia.

Tutti i campioni conservati in RNAlater hanno portato all’estrazione di RNA di ottima qualità, che è stato dunque utilizzato per la creazione di librerie per RNA-sequencing in modalità 3’tag, utilizzando il kit Lexogen QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep. Il sequenziamento delle librerie ha permesso di ottenere dati grezzi che, una volta sottoposti alla procedura di trimming, sono stati mappati su un trascrittoma di riferimento generato partendo da campioni prelevati nell’ambito di precedenti spedizioni Antartiche, ma pubblicato su una rivista peer-reviewed internazionale.

I risultati delle analisi di espressione genica differenziale hanno portato all’evidenziazione di scarse alterazioni a livello trascrittomico nei tre tessuti selezionati, indipendentemente dal tempo sperimentale. Tuttavia, l’analisi istologica condotta in parallelo sui tessuti ha evidenziato significative alterazioni, che complessivamente portano a pensare che questa specie di bivalve sia scarsamente in grado di rispondere ad alterazioni di temperatura. I risultati sono attualmente in fase di organizzazione, alla quale seguirà la stesura di un lavoro scientifico che verrà auspicabilmente pubblicato su una rivista scientifica internazionale.

Chionodraco hamatus

Nel corso della XXXIII spedizione, tre esemplari adulti di Chionodraco hamatus sono stati pescati mediante rete grazie alla collaborazione con Edoardo Calizza, Armando Macali e Ennio Cocca. Nel corso della XXXIV spedizione, come da PEA, si è reso necessario il reperimento di max. 10 individui e per questo sono state effettuate 4 uscite in gommone in zone di costa da campo Icaro a Adelie Cove per pesca al bolentino, senza successo. E’ stata preparata quindi una rete da pesca di tipo barracuda di circa 40 metri, armata con cime, zavorre e boe di segnalazione. Dopo tre sessioni di pesca, sono stati raccolti 11 esemplari di icefish. Due di questi esemplari, femmine in avanzata fase di ovulazione, sono state rilasciate in mare. Nove esemplari di icefish sono stati utilizzati analogamente a quanto riportato per Trematomus nello stesso periodo, e i campioni ottenuti sono stati congelati a -20°C o mantenuti a +4°C per la spedizione.

I campioni raccolti di C. hamatus sono stati di grande utilità per consentire di approntare analisi di RT-PCR su alcuni trascritti target, per validare dati di espressione derivanti da un trascrittoma preparato sulla base di campioni prelevati in precedenti progetti PNRA. I risultati di queste analisi sono contenuti in un manoscritto in fase di peer-review.

Per quanto riguarda le attività in sinergia con il progetto PNRA16_00226, è stato analizzato il trascrittoma di C. hamatus a partire dell’RNA totale estratto da milza, rene, fegato, cervello e muscolo scheletrico. Sono state impiegate cinque repliche biologiche per le estrazioni di RNA da muscolo scheletrico mentre un'unica replica è stata utilizzata per gli altri tessuti. Un totale di nove librerie non normalizzate sono state quindi sintetizzate utilizzando il kit Illumina SureSelect Strand Specific RNA-Seq Library Preparation Kit e sono poi state sequenziate in modalità paired-end mediante Illumina HiSeq2500.

I dati di espressione di C. hamatus e della specie congenerica C. myersi (analizzato nel progetto in cluster sopra citato) di 5 repliche biologiche di muscolo sono stati confrontati con dati analoghi (muscolo di individuo adulto, 5 repliche biologiche) di 3 specie modello (Danio rerio, Oreochromis niloticus e Gasterosteus aculeatus) disponibili in database pubblici. Il profilo di espressione delle due specie di icefish è del tutto sovrapponibile, mentre la divergenza di espressione tra icefish e le specie modello potrebbe essere ricondotta sia alla peculiare condizione di assenza di emoglobina di icefish sia alla fisiologica risposta alle temperature inferiori allo zero, sono stati inclusi nell’analisi anche dati di RNA-seq di muscolo di Nototenoidei antartici a sangue rosso quali Dissostichus mawsoni, Notothenia coriiceps e Parachaenichthys charcoti. 

L’ Analisi di ortologia tramite il software OrthoFinder ha permesso di identificare le relazioni di omologia per i geni espressi nelle diverse specie e di produrre quindi un dataset di geni ortologhi. L’analisi dei dati di espressione di questo dataset ha mostrato una chiara separazione tra C. myersi e tutte le altre specie, incluse le specie antartiche a sangue rosso. Il confronto dei profili di espressione tra C. myersi e le tre specie modello ha permesso di identificare 2758 e 2813 gruppi di ortologia (OG) rispettivamente sovraespressi e sottoespressi in icefish. Simili i risultati ottenuti confrontando C. myersi e i Nototenoidei a sangue rosso, con 1630 OG sovraespressi e 2882 OG sottoespressi in icefish. 

Un’analisi ad hoc di Gene Set Enrichment (GSEA) ha inoltre permesso di evidenziare come processi biologici legati al metabolismo e alla biogenesi mitocondriale risultino significativamente arricchiti tra i geni differenzialmente espressi in icefish sia nel confronto con le 3 specie modello, sia nel confronto con i Nototenoidei a sangue rosso. Questi risultati evidenziano il potenziale ruolo dei mitocondri nell’adattamento alle basse temperature ma soprattutto alla perdita di emoglobina.

I campioni ottenuti da C. hamatus sono inoltre stati utilizzati per lo studio della diversità molecolare delle sequenze MHC Class II β in questa specie, evidenziando una notevole diversità molecolare per il gene ChhaDAB, abbinata ad una scarsissima diversità molecolare per il gene ChhaDBB.

I risultati ottenuti riguardo agli effetti morfo-fisiologici dello stress termico sulle branchie di questa specie sono stati pubblicati su una rivista internazionale (vedi pubblicazione 5).

Infine, il trascittoma di riferimento ha permesso di identificare e di studiare le proprietà biochimiche e la storia evolutiva delle perossiredossine, un’importante famiglia proteica nel contesto della risposta da stress ossidativo.

Trematomus bernacchi

Nel corso della XXXIII spedizione, a seguito dell’effettuazione dei primi fori nella banchisa, sono stati raccolti circa 50 Trematomus bernacchii mediante nassa innescata con gamberi argentini, da una profondità di circa 25 metri. Sono stati in seguito sacrificati 5 esemplari di riferimento. I restanti esemplari sono stati acclimatati per un periodo variabile tra 5 e 11 giorni e 40 di essi sono stati divisi in maniera casuale nelle 2 vasche sperimentali, una a temperatura vicina a quella ambientale (controlli) e l’altra a temperatura aumentata di 1,5°C (sperimentali). L’esperimento è partito con il campionamento da ciascuna vasca a tempo 0 (5 esemplari) e a tempo 6 ore (5 esemplari). Sono stati effettuati 2 ulteriori campionamenti a 7 giorni (5 esemplari) e a 19 giorni (5 esemplari) dall’inizio del trattamento. Le temperature nelle vasche sono state monitorate con un data logger Tinytag Aquatic 2. Da ciascun esemplare, sottoposto ad eutanasia in tricaina, sono stati prelevati branchie, rene cefalico, fegato, muscolo scheletrico e cervello, i quali sono stati immersi in RNAlater per 24 ore e successivamente stoccati a -20°C per l’invio in Italia. Sono stati anche fissati per l’analisi istologica i seguenti campioni di tessuto: sangue, branchie, fegato, gonade, rene cefalico e muscolo scheletrico, conservati a +4°C per l’invio in Italia.

Nel corso della XXXIV spedizione, otto ulteriori esemplari di T. bernacchii sono stati utilizzato per il prelievo di organi e tessuti per la preparazione acidi nucleici, in particolare di milza, rene cefalico, intestino, branchie, muscolo, cervello, fegato, cellule peritoneali sono stati isolati e frammenti denaturati in Tri-Reagent (Sigma). Le cellule peritoneali sono in qualche caso state stimolate in vitro con particelle di lattice per 1 ora per valutare le capacità fagocitiche. I campioni sono stati congelati a -20°C o mantenuti a +4°C per la spedizione.

I campioni sottoposti ad estrazione di DNA in Italia hanno portato all’ottenimento di RNA di qualità variabile, che in alcuni casi purtroppo non è stata ritenuta sufficiente per procedere con la preparazione di libreria RNA-seq. Nel dettaglio, è stato possibile ottenere RNA di qualità accettabile per branchie, muscolo scheletrico e cervello, mentre non è stato ritenuto opportuno scartare i campioni di rene cefalico e fegato. Le librerie per RNA-sequencing sono state preparate in modalità 3’tag, utilizzando il kit Lexogen QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep. Il sequenziamento delle librerie ha permesso di ottenere dati grezzi che, una volta sottoposti alla procedura di trimming, sono stati mappati sul genoma di riferimento, reso disponibile dalla pubblicazione di dati relativi al Vertebrate Genome Project.

L’analisi statistica di espressione differenziale ha messo in luce in primo luogo la difficoltà nel mettere a punto un esperimento controllato su questi organismi nelle strutture della MZS. I campioni di controllo hanno difatti mostrato un notevole stress legato all’acclimatamento, che si è esacerbato con in passare del tempo, finendo per mascherare in larga parte gli effetti dello stress dovuto all’innalzamento sperimentale della temperatura. Queste alterazioni non hanno tuttavia del tutto nascosto le principali modificazioni prodotte a livello trascrittomico, in particolare nell’ultimo sperimentale, in particolare nel tessuto cerebrale, che ha mostrato notevoli segnali di sofferenza. Il notevole stress patito dagli esemplari è stato confermato dall’osservazione istologica dei campioni prelevati in parallelo a quelli sottoposti ad RNA-seq, nei quali in particolare è stata riscontrata una significativa alterazione nella forma e dimensione degli eritrociti, osservazione che da letteratura è legata per l’appunto ad una situazione di sofferenza.

Pseudorchomene plebs

L’anfipode Pseudorchomene plebs è stato più volte catturato nel corso della XXXIII spedizione, in genere subito sotto la banchisa, dal gruppo coordinato da Simone Canese e Erica Carlig che ci ha gentilmente donato gli esemplari. Viste le dimensioni ridotte degli animali (alcuni millimetri) abbiamo potuto allestire un terzo set sperimentale di esposizione a variazione di temperatura. In ciascuna delle vasche che ospitavano A. colbecki abbiamo installato delle beute galleggianti in cui abbiamo posto circa 30 esemplari. Inizialmente sono stati sacrificati 5 esemplari di riferimento. L’esperimento è partito con il campionamento da ciascuna vasca a tempo 0 (5 esemplari) e a tempo 6 ore (5 esemplari). Sono stati effettuati 2 ulteriori campionamenti a 7 giorni (5 esemplari) e a 20 giorni (5 esemplari) dall’inizio del trattamento. Gli esemplari di volta in volta campionati sono stati immersi in RNAlater per 24 ore e successivamente stoccati a -20°C per l’invio in Italia. Alcuni esemplari sono stati invece fissati per l’analisi istologica e conservati a +4°C per l’invio in Italia.

Sfortunatamente la qualità dell’RNA estratto in un numero piuttosto significativo di campioni è risultata essere di qualità piuttosto scarsa. Nonostante ciò, è stato possibile in ogni caso ricavare del materiale utilizzabile, che ha permesso di ottenere delle librerie RNA-seq con kit Lexogen Sense mRNA, sequenziate in modalità paired-end, tali da poter ricavare un assemblaggio de novo di buona qualità, il primo disponibile per questa specie. Per quanto non sia al momento procedere ad una dettagliata analisi di espressione genica differenziale, l’elemento di maggior interesse di questa risorsa è la presenza di un notevole numero di trascritti derivanti da un parassita endocellulare appartenente al genere Hematodinium, che viene dunque descritto per la prima volta in un anfipode e per la prima volta in ambiente antartico.

L’assemblaggio trascrittomico è stato dunque attentamente processato per ottenere due liste di contig distinte, riconducibili ad ospite e parassita.

Eusirus giganteus

Parallelamente alla cattura degli esemplari di P. plebs descritta in dettaglio sopra, è stato anche prelevato come bycatch un singolo esemplare giovanile di un crostaceo anfipode appartenente al genere Eusirus. Il campione è stato processato in modo analogo a quanto fatto per P. plebs, permettendo di ottenere una libreria paired-end, sequenziata con successo. Tale risorsa ha permesso di stabilire che l’esemplare appartenesse alla specie Eusirus cf. giganteus clade III, identificata da precedenti studi come specie criptica presente nel mare di Ross.

L’analisi del trascrittoma ha messo in luce notevoli adattamenti al clima polare, che in particolare coinvolgono l’espressione ad altissimi livelli delle emocianine, che complessivamente contribuiscono ad oltre il 40% dello sforzo trascrizionale complessivo. Nella nostra interpretazione, ciò rappresenta un adattamento analogo a quello descritto nei cefalopodi Antartici, in cui la maggiore affinità di legame dell’ossigeno a basse temperature, che non ne permette un efficiente rilascio nei tessuti, è controbilanciata da una forte sovraespressione di queste proteine carrier.

1. Moro G, Buonocore F, Barucca M, Spazzali F, Canapa A, Pallavicini A, Scapigliati G, Gerdol M. Marine Genomics 44:61-64 – 2019. The first transcriptomic resource for the Antarctic scallop Adamussium colbecki

2. Bargelloni L, Babbucci M, Ferraresso S, Papetti C, Vitulo N, Carraro R, Pauletto M, Santovito G, Lucassen M, Mark FC, Zane L, Patarnello T. Communications Biology 2:443 – 2019. Draft genome assembly and transcriptome data of the icefish Chionodraco myersi reveal the key role of mitochondria for a life without hemoglobin at subzero temperatures

3. Gerdol M, Lucente D, Buonocore F, Poerio E, Scapigliati G, Mattiucci S, Pallavicini A, Cimmaruta R. Scientific Reports, 9(1), 5523 – 2019. Molecular and Structural Characterization of MHC Class II β Genes Reveals High Diversity in the Cold-Adapted Icefish Chionodraco hamatus

4. Garofalo F, Santovito G, Amelio D. Marine Pollution Bulletin 141:194-204 – 2019. Morpho-functional effects of heat stress on the gills of Antarctic T. bernacchii and C. hamatus

5. Ansaloni F, Gerdol M, Torboli V, Fornaini NR, Greco S, Giulianini PG, Coscia MR, Miccoli A, Santovito G, Buonocore F, Scapigliati G, Pallavicini A. International Journal of Molecular Science 22(4):1812 – 2021. Cold Adaptation in Antarctic Notothenioids: Comparative Transcriptomics Reveals Novel Insights in the Peculiar Role of Gills and Highlights Signatures of Cobalamin Deficiency

6. Greco S, D’Agostino E, Manfrin C, Gaetano AS, Furlanis G, Capanni F, Santovito G, Edomi P, Gulianini PG, Gerdol M. Biocell 45(6):1611-1619 – 2021. RNA-sequencing indicates high hemocyanin expression as a key strategy for cold adaptation in the Antarctic amphipod Eusirus cf. giganteus clade g3

7. Rizzotti D, Manfrin C, Gerdol M, Greco S, Santovito G, Giulianini PG. Journal of Thermal Biology 103: 103139 – 2021. Morphological analysis of erythrocytes of an Antarctic teleost under heat stress: Bias of the stabling effect

8. Greco S, Gaetano AS, Furlanis S, Capanni F, Manfrin C, Giulianini PG, Santovito G, Edomi P, Pallavicini A, Gerdol M. Fishes 2022. 7(6):387. Gene expression profiling of Trematomus bernacchii in response to thermal and stabling stress

9. Greco S, Gaetano AS, Manfrin C, Capanni F, Santovito G, Pallavicini A,  Giulianini PG, Gerdol M. Stresses 2023. 3(2), 475-487. The Antarctic Scallop Adamussium colbecki (Smith 1902) is unable to transcriptomically respond to captivity and moderate thermal stress

10. Greco S, Voltarel G, Gaetano AS, Manfrin C, Pallavicini A, Giulianini PG, Gerdol M. Fishes 2023. 8(6):276. Comparative Transcriptomic Analysis Reveals Adaptive Traits in Antarctic Scallop Adamussium colbecki