Trophic-symbiotic interactions among bacteria, meiobenthos, and macrobenthos in the Antarctic environment

Sebbene l'ecologia della macrofauna, della meiofauna e dei batteri sia stata ampiamente studiata, ancora scarse sono le informazioni sui tre gruppi bentonici nel Mare di Ross, in Antartide, e sulle interazioni trofico-simbiotiche che intercorrono tra di essi. Il progetto si è quindi proposto di indagare le interazioni tra batteri e fauna bentonica (meio- and macrofauna). Il progetto è stato strutturato su di un arco temporale di 2 anni, per ottenere risultati significativi riguardanti la dinamica di popolazione dei gruppi bentonici oggetto di studio (che è nota essere nettamente più lenta di quella delle comunità planctoniche), e per consentire la verifica dei meccanismi di comunicazione cellulare e di produzione delle biomolecole di origine microbica.

L’obiettivo del progetto è stato lo studio dell'ecologia della macrofauna, della meiofauna e dei batteri presenti in Antartide con particolare riferimento all’area compresa nel Mare di Ross. Pertanto scopo del progetto è stata l’indagine della comunità batterica e della fauna bentonica (meio- and macrofauna) presenti nei campioni di acqua e sedimenti raccolti durante la XXXIII e XXXIV campagna in Antartide. Lo studio è stato difatti strutturato su un periodo di due anni in considerazione del fatto che la dinamica del benthos marino è nettamente più lenta di quella delle comunità planctoniche. Per quanto riguarda la fauna bentonica, gli obiettivi hanno incluso la stima dell’abbondanza, della biomassa e la distribuzione spaziale lungo transetti; a tali indagini si è ritenuto opportuno associare la valutazione di fattori ambientali, come Eh e materia organica nel sedimento e salinità, temperatura e pH nella colonna d'acqua. Per quanto concerne la comunità microbica, lo scopo del progetto ha previsto lo studio della biodiversità della comunità microbica antartica, che risulta di notevole interesse sia per l’aspetto evoluzionisitico che in relazione alle potenziali applicazioni biotecnologiche. Obiettivi principali in tal senso hanno previsto la identificazione tassonomica delle specie esistenti e di eventuali nuovi microorganismi estremofili mediante le classiche tecniche per l’assegnazione tassonomica; nonché la valutazione della produzione di molecole sia a basso peso molecolare quali enzimi e/o molecole potenzialmente coinvolte in processi di “quorum sensing” (QS).

Gli studi condotti nell’ambito di questo progetto hanno interessato l’analisi della comunità batterica e della fauna bentonica (meio- and macrofauna) presenti nell’area compresa nel mare di Ross. Le attività di campionamento necessarie alla raccolta di campioni da studiare sono state svolte nell’ambito della XXXIII e della XXXIV Spedizione Italiana in Antartide.

Per quanto concerne la XXXIII campagna, le attività di campionamento sono iniziate il giorno 10 dicembre 2017 e sono state protratte fino al 3 febbraio 2018: durante tale periodo sono state utilizzate 3 modalità di campionamento in base all’agibilità del pack e della sua presenza nelle zone antistanti alla Base “Mario Zucchelli” (MZS) (Figura 1). Oltre al prelievo di sedimento di battigia per le analisi delle comunità bentoniche, sono stati prelevati anche campioni di acqua e sedimenti per successive analisi chimico-fisiche al fine di caratterizzare l’ambiente in cui si trovavano le comunità al momento del prelievo. Il campionamento da Pack è stato effettuato utilizzando i fori aperti per progetti precedenti, ricorrendo all’ausilio della benna Van Veen da 5 litri e del nucleo di sommozzatori. I punti campionati hanno incluso: Mareografo e Amorphus Glaciar, entrambi ad una profondità di 20 metri circa; e, grazie al supporto dei palombari della Marina Militare e degli incursori dell’Esercito Italiano, la Spiaggetta di Tethys Bay, il punto di coordinate 74°40.545' S, 164°04.095' E e all’interno di Adelie Cove, nell’area protetta ASPA 161. Il campionamento da battigia, richiesto ed autorizzato nel corso della missione dal Comitato della Ricerca Polare, è stato possibile nei siti denominati Edmons Point e Cape Halletet. Il campionamento da mare è stato effettuato da gommone, ed ha permesso il prelievo dei campioni in zone prestabilite all’interno dell’ASPA 161, quali Adelie Cove, Campo Faraglione e in un’area intermedia ad esse, alle batimetrie dei 20 e 50 metri. Tutti campioni raccolti per le analisi del macrobenthos, sono stati setacciati in acquario mediante pompa ad acqua di mare, eliminando tutta la parte inorganica ed organica inferiore ad 1 mm di grandezza, mentre una parte dei campioni setacciati è stata smistata in laboratorio allo stereomicroscopio.

Per quanto concerne la XXXIV campagna, le attività di campionamento sono state effettuate nel periodo compreso tra l’8 gennaio 2019 e l’1 febbraio 2019. Durante tale periodo sono stati campionati 12 siti (Figura 2) di cui 6 nelle immediate vicinanze la base italiana Mario Zucchelli (MZS) e 6 all’interno dell’Area Protetta ASPA 161. Tutti i campionamenti sono stati svolti da mare, effettuando oltre al prelievo di sedimento per lo studio delle comunità bentoniche a differenti scale (micro, meio e macro fauna), anche la raccolta di campioni di acqua e sedimenti per successive analisi chimico-fisiche al fine di caratterizzare l’ambiente in cui si trovavano le comunità (microbica, meio- e macrofauna) al momento del prelievo. L’efficacia della struttura montata sul gommone ha permesso il prelievo dei campioni nei siti derivanti dal campionamento effettuato nel corso della XXXIII spedizione, sia all’interno dell’ASPA 161, quali Adelie Cove, Campo Faraglione e in un’area intermedia ad esse (denominata ASPA1), sia in aree limitrofe la base italiana (denominate Rod Bay, Mareografo e spiaggetta di Tethys Bay) alle batimetrie di 20 e 50 metri.

Per quanto riguarda lo studio della meio- e macrofauna, i campioni prelevati nelle stazioni posizionate intorno alla Base Antartica Mario Zucchelli sono stati ivi congelati a -20°C e trasportati in Italia per le successive analisi di laboratorio.

In particolare:

• seguendo i protocollo Castelli et al. (2003) i campioni di sedimento sono stati smistati allo stereomicroscopio al fine di prelevare gli organismi macrozoobentonici dalla frazione inorganica, i quali sono stati primariamente classificati per grandi taxa e fissati in etanolo al 70%. L’identificazione degli organismi appartenenti a ciascun taxon è proceduta al più basso livello tassonomico possibile e a ciascuna specie è stata attribuita una categoria trofica per un’analisi di diversità funzionale della comunità macrobentonica. La nomenclatura binomia di ciascuna specie è stata in ultimo controllata nel registro mondiale delle specie marine WoRMS (http://www.marinespecies.org).
• I sedimenti relativi ai campioni di Meiobenthos sono stati decantati e setacciati ripetute volte attraverso un setaccio con maglia 30 µm. Quando i sedimenti erano costituiti da fango la frazione rimasta all’interno del setaccio è stata risospesa e centrifugata in presenza di del gel colloidale di silice Ludox HS40 (Heip et al., 1985). Tutti gli organismi animali meiobentonici sono stati contati allo stereomicroscopio e classificati per grandi taxa. Per quel che riguarda il phylum Nematoda, per ogni campione sono stati prelevati circa 100 individui, fissati in glicerina anidra secondo il protocollo Formaldeide-Etanolo-Glicerina (De Grisse, 1969) e montati su vetrini ad anello di paraffina per l'identificazione al microscopio ottico composto. I nematodi, quindi, sono stati identificati al livello di genere e classificati secondo la letteratura specialistica e in accordo con le descrizioni tassonomiche disponibili sul database NeMys (http://www.nemys.ugent.be). La biomassa dei nematodi è stata calcolando dal loro biovolume (Andrassy, 1967) secondo la formula: V = L x W² x 0.063 x 10^-5, dove L è la lunghezza dell’organismo e W la sua larghezza. In ultimo i nematodi sono stati categorizzati in gilde trofiche sulla base della morfologia della cavità boccale (Wieser, 1953).
• I campioni di acqua interstiziale sono stati filtrati utilizzando filtri di cellulosa con porosità pari a 0.20µm, successivamente trattati con acqua ossigenata (100µl in 100 ml di campione) per la digestione del contenuto organico. I campioni sono stati quindi frazionati in due aliquote per la determinazione di ioni e metalli. Una delle due aliquote, prima di essere utilizzata per la lettura in cromatografia ionica, è stata utilizzata per la lettura di parametri chimico-fisici quali: pH, ossigeno disciolto, conducibilità, sali disciolti utilizzando una sonda multiparametrica (VWR pHenomenal/ pH1100L). Per quanto concerne l’analisi della concentrazione ionica, i campioni di acqua interstiziale sono stati inviati al sistema cromatografico ICS1100 equipaggiato con una doppia colonna per la determinazione simultanea di anioni e cationi. Gli anioni sono stati rilevati con una colonna AS22 che lavora con un volume di campione pari a 100 µl ed una soluzione tampone 3.5mM di sodio carbonato/sodio bicarbonato come eluente; i cationi sono stati determinati tramite una colonna CS12A che lavora con un volume di 25 µl di campione ed una soluzione 20 mM di acido metansolfonico come eluente. Sia per gli anioni sia per i cationi, la curva di calibrazione è stata elaborata usando soluzioni multistandard certificate. Ciò ha permesso di rilevare Cl^-, F^-, Br^-, NO₂^-, NO₃^-, PO₄^3-, SO₄^2-, Li⁺, Na⁺, K⁺, NH₄⁺, Ca²⁺ e Mg²⁺ (come specie inorganiche) e HCOO^-, CH₃COO^-, C₂O₄^2- (come specie organiche). I metalli pesanti in soluzione (Pb²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ e Zn²⁺) sono stati determinati usando un metodo polarografico che lavora con un elettrodo al mercurio per le misure e uno ad Ag/AgCl come controllo, permettendo quindi la determinazione simultanea di zinco, cadmio, piombo e rame.
• I campioni di sedimento sono stati analizzati per valutarne la composizione granulometrica. I campioni precedentemente seccati in stufa a 60° per 48h sono stati pesati e posti in una colonna di setacci per la determinazione della percentuale di ghiaia (frazione >2mm), sabbia (0.063mm<frazione<2mm) e fango (frazione < 0.063mm). La percentuale di Carbonio Organico Totale (TOC) è stata inoltre stimata seguendo la procedura descritta da Schumacher (2002).

I dati così acquisiti sono in fase di elaborazione tramite software statistici ed euristici per la preparazione di articoli scientifici da sottoporre alle principali riviste di settore.

Studio della comunità microbica

Per quanto riguarda lo studio della comunità microbica, l’attenzione è stata inizialmente focalizzata sui campioni prelevati in due aree comprese nell’ASPA 161, alla batimetria di 20 metri. I campioni in questione, etichettati come ASPA1_20 ed ASPA2_20 sono stati analizzati con due diversi approcci ovvero culture-based e metagenomico, per identificare le specie batteriche in essi presenti. Lo studio culture-based, volto all’isolamento di cellule e loro identificazione tassonomica, è stato eseguito effettuando un arricchimento su diversi mezzi di coltura ovvero: Marine Broth (MB) (comp. per L: Peptone 5 g, Yeast extract 1 g in 0.45 μm di acqua di mare filtrata), R2A (comp. per L: Yeast extract 0.5 g, Peptone 0.5 g, Casamino acids 0.5 g, Glucosio 0.5 , Na-piruvato 0.3 g, K₂HPO₄ 0.3 g, MgSO₄•7H₂O 0.05 g, pH 7.2), TH (comp. per L: peptone 8 g, yeast extract 4 g ed NaCl 2g) and M162. Mediante tale approccio è stato possibile identificare ed isolare 16 diversi strain cellulari per i quali è stato effettuato il sequenziamento del gene del 16S rRNA mediante il server EzTaxon-e (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon), ovvero un database ad accesso aperto nel quale sono catalogate le sequenze dei geni di 16S rRNA di specie batteriche. Dal confronto delle sequenze geniche ottenute con il database in oggetto è stato possibile dedurre che la maggior parte degli strain microbici isolati appartengono ai generi Psychrobacter e Lyfsonia.

• Federica Semprucci, Luca Appolloni,*  Eleonora Grassi, Luigia Donnarumma, Lucia Cesaroni, Giuseppina Tirimberio, Elena Chianese, Paola Di Donato, Giovanni Fulvio Russo, Maria Balsamo, Roberto Sandulli: Antarctic Special Protected Area 161 as a Reference to Assess the Effects of Anthropogenic and Natural Impacts on Meiobenthic Assemblages, Diversity 2021, 13, 626. https://doi.org/10.3390/d13120626
• DI DONATO, Paola; Leone, Luigi; Finore, Ilaria; Abbamondi, Roberto; Poli, Annarita; Tommonaro, Giuseppina; Appolloni, Luca; Donnarumma, Luigia; Sandulli, Roberto; Russo, Giovanni, Fulvio; Nicolaus, Barbara. Extremophiles from Antarctica: the bacterial community living in association with the benthic fauna in the Ross sea, 2019, Proceedings of 60th Congress of the Italian Society of Biochemistry and Molecular Biology (SIB2019)
• Appolloni L, Di Donato P, Donnarumma L, Semprucci F, Cesaroni L, Grassi E, Balsamo M, Rendina F, Ferrigno F, Russo GF, Sandulli R: Valutazione preliminare degli impatti antropici e naturali sule comunità meiobentoniche nella Baia di Terranova (Antartide). Convegno Nazionale della Società di Biologia Marina Mediterranea (SIBM). Giugno 2020.
• Attività di divulgazione e public engagement: Seminario dal titolo "Racconto di un lungo viaggio alla scoperta della biodiversità marina bentonica in ambiente estremo" presso il Liceo Scientifico "don Lorenzo Milani" di Gragnano (NA), 9/4/2019; Seminario dal titolo "Una curiosità senza limiti: La ricerca ai confini del mondo" presso Istituto Superiore Statale "Pitagora", Pozzuoli (NA), 5/4/2019.